Sulfametoksazol adalah antibakteri golongan sulfonamida. Sulfametoksazol sering digunakan sebagai bagian dari kombinasi yang sinergis dengan trimetoprim dalam rasio 5:1 pada kotrimoksazol. Penggunaan sulfametoksazol sebagai antibakteri pada banyak penyakit infeksi cukup tinggi. Kebutuhan akan produk sulfametoksazol dalam pengobatan telah mendorong banyak industri farmasi untuk membuat produk me too (copy) berupa tablet atau kapsul sulfametoksazol, baik sebagai obat generik atau obat bermerek dagang. Dalam rangka menjamin efikasi, keamanan, dan mutu produk me too perlu dilakukan studi bioekivalensi (BE). Terkait dengan studi BE, diperlukan metode analisis yang valid untuk menentukan kandungan sulfametoksazol dalam plasma darah manusia. Penelitian ini memvalidasi metode spektrofotometri cahaya tampak untuk analisis sulfametoksazol dalam plasma manusia (in-vitro). Kondisi spektrofotometer yang dioptimasi meliputi panjang gelombang serapan maksimum 536 nm dan waktu stabil untuk pengukuran 20 menit setelah preparasi. Nilai batas konsentrasi terendah (Lower Limit of Quantitation/LLoQ) sebesar 2,0197 ug/mL. Ketelitian metode ditunjukkan dengan nilai Koefisien Variasi pada LLoQ sebesar 3,61 – 12,70 %, konsentrasi rendah 1,11 – 2,16 %, konsentrasi sedang 0,05 – 2,09 % dan konsentrasi tinggi 0,20 – 3,89 %, serta memberikan ketepatan yang baik dengan perolehan kembali rentang 95,74 – 109,57 %. Metode spektrofotometri cahaya tampak yang dikembangkan adalah metode yang valid sesuai Food and Drug Association (FDA).