Daun jati belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.) termasuk dalam famili Sterculiaceae dan dikenal memiliki berbagai manfaat dalam pengobatan tradisional, seperti untuk hipertensi, kolesterol tinggi, dan diabetes. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh iradiasi gamma pada ekstrak etanol daun jati belanda terhadap profil kromatografi lapis tipis (KLT)-densitometri, kandungan senyawa metabolit sekunder, serta aktivitas sitotoksiknya terhadap sel leukemia L1210. Ekstrak etanol daun jati belanda yang diperoleh dari penelitian sebelumnya diiradiasi dengan dosis 5, 7, 9, dan 11 kGy, kemudian ekstrak tersebut dianalisis menggunakan KLT-densitometri, serta dilakukan analisis kandungan metabolit sekunder dan uji aktivitas sitotoksik terhadap sel leukemia L1210. Hasil analisis KLT-densitometri menunjukkan adanya penurunan luas puncak seiring dengan peningkatan dosis iradiasi dari 5 hingga 11 kGy. Analisis kandungan metabolit sekunder mengidentifikasi adanya flavonoid, terpenoid, tanin, dan saponin. Nilai IC50 yang diperoleh pada masingmasing dosis 0, 5, 7, 9, dan 11 kGy adalah 19,1; 20,1; 22,7; dan 26,8 µg/mL. Kesimpulan dari penelitian ini adalah bahwa profil KLT-densitometri tidak berubah oleh iradiasi gamma pada dosis 5, 7, 9, dan 11 kGy, tetapi mempengaruhi luas puncak kromatogram. Kandungan metabolit sekunder dalam ekstrak etanol daun jati belanda, yaitu flavonoid, terpenoid, tanin, dan saponin, serta aktivitas sitotoksik terhadap sel leukemia L1210 tidak ada perubahan bermakna dengan nilai IC50 < 30 µg/mL.