Biji jintan hitam (Nigella sativa L) mengandung berbagai senyawa kimia yang berkhasiat dalam pengobatan, termasuk thymoquinone yang memiliki aktivitas sebagai ekspektoran. Penelitian ini bertujuan menghasilkan sediaan ekstrak etanol biji jintan hitam (Nigella sativa L) yang memiliki efektivitas ekspektoransia dan aman digunakan melalui pengujian toksisitas akut. Uji efektivitas ekspektoransia dengan pemberian sediaan secara oral pada 5 kelompok yaitu, kelompok negatif diberi Na CMC, kelompok positif Obat Batuk Hitam(OBH) dan kelompok dosis 1,75 mg/kgBB, 3,5 mg/kgBB, 7 mg/kgBB. Setelah 30 menit, hewan uji diinjeksikan phenol red sebagai indikator. Trakea mencit diambil dan dicuci dengan larutan saline kemudian disonikasi serta ditambahkan NaOH. Dibaca densitas optikal (DO) sampel yang telah dipreparasi menggunakan Elisa reader pada panjang gelombang 546 nm dan didapatkan % ekspektoran sediaan ekstrak etanol biji jintan hitam pada kontrol positif OBH sebesar 2,23% dan dosis 1, 2, dan 3 secara berturut-turut sebesar 6,14%; 12,20%, 1,21%. Data yang dianalisis menggunakan analisis varian satu arah (One Way ANOVA) dengan taraf kepercayaan 95%. Uji toksisitas akut dilakukan dengan metode fixed dose dengan pemberian secara oral, kemudian pengamatan selama 14 hari pada 5 kelompok, 5 mg/kgBB, 50 mg/kgBB, 300 mg/kgBB, 2000 mg/kgBB, 5000 mg/kgBB. Hasil uji toksisitas akut diperoleh nilai LD50 sediaan ekstrak etanol biji jintan hitam adalah >5000 mg/kgBB (tidak toksik/kategori 5). Dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanol biji jintan hitam (Nigella sativa L) memiliki potensi ekspektoran dan aman digunakan secara in vivo.